تریپسین، سرین پروتئازی است که از پانکراس خوک گرفته می شود و به طور شایع برای جدا کردن سلول های چسبیده به فلاسک محیط کشت و همچنین جدا کردن سلول ها از هم استفاده می شود.  همچنین EDTA (اتیلن دی آمین تترا استیک اسید) به عنوان عامل شلاته کننده اغلب برای افزایش فعالیت آنزیماتیک تریپسین افزوده می شود. EDTA از طریق خنثی کردن یون های کلسیم و منیزیم که باعث افزایش اتصال سلول به سلول می شوند عمل می کند.

ویژگی:

• این محصول، تریپسین 0.25 درصد و EDTA در بافر فسفات سالین دالبکو است.

نکات

• مهارکننده های سرین پروتئاز، مانند DFP، TLCK، APMSF، AEBSEF، و آپروتینین، تریپسین را مهار می کنند.
• غلظت تریپسین مورد نیاز برای جدا کردن سلول ها از سوبسترا، ابتدائا به نوع سلول،مدت و تراکم کشت سلول ، بستگی دارد.
• این محصول بصورت منجمد در دمای 10- تا 40- درجه سانتیگراد نگهداری می شود. از فریز و ذوب کردن مکرر اجتناب کنید.
• انکوبه کردن مدت طولانی سلول ها با غلظت های خیلی بالای تریپسین می تواند باعث آسیب به غشاء سلولی و در نتیجه مرگ سلول شود.
• محلول کردن تریپسین یا رقیق سازی آن از یک محلول غلیظ، باید با یک محلول نمک بافری فاقد کلسیم یا منیزم انجام شود.
• محلول های تریپسین باید شفاف و عاری از هر گونه ذرات معلق باشد. در صورتی که محلول کدر بوده یا حاوی ذراتی معلق و یا رسوب است از آن استفاده نکنید.

روش استفاده

قبل از اجرای هر گونه پروتوکل، غلظت مناسب محلول تریپسین-EDTA  و همچنین زمان انکوباسیون لازم برای جداسازی را بصورت تجربی برای رده های سلولی مورد نظر خود تعیین کنید. غالبا زمان لازم برای جداسازی سلول ها از سطح، به نوع سلول، تراکم سلولی، غلظت سرم در محیط رشد، و فاصله زمانی از آخرین ساب کالچر بستگی دارد.

• با استفاده از پیپت، محیط استفاده شده را از ظرف کشت خارج کنید.
• با افزودن بافر نمکی متعادل (PBS) فاقد کلسیم و منیزیم به کناره فلاسک در سمت مقابل سلولها، تک لایه سلولی را شستشو دهید.
• با تکان دادن آهسته فلاسک به مدت 1 تا 2 دقیقه، لایه سلولی را شستشو داده و محلول شستشو را دور بریزید.
• محلول تریپسین-EDTA 25%  را از سمت مقابل سلول ها به کناره فلاسک بیفزایید.، میزان محلول تریپسین مورد استفاده باید به اندازه ای باشد که روی لایه سلولی را بپوشاند.
• فلاسک را به آرامی تکان داده تا مطمئن شوید که محلول جداسازی، کل لایه سلولی را پوشانده است.
• فلاسک را به مدت 2 تا 3 دقیقه در 37 درجه سانتیگراد انکوبه کنید. روند جداسازی را با قرار دادن فلاسک زیر میکروسکوپ اینورت بررسی کنید. زمانی که جداسازی کامل شود، سلول ها معلق بوده و گرد به نظر می رسند. علاوه بر تکان دادن آرام، در مورد فلاسک های رده سلولی که بطور مشخص جداسازی آنها از لایه زیرین مشکل است ضربه زدن باعث تسریع جداسازی می شود.

نکته: توجه داشته باشید که زمان دقیق مورد نیاز برای جداسازی سلول ها، بر اساس رده سلولی متفاوت است. فرایند جداسازی باید پیوسته کنترل و نظارت شود تا از آسیب سلول ها جلوگیری شود.

• به محض تکمیل جداسازی سلول، سرم حاوی محیط کامل را به فلاسک بیفزایید تا تریپسین را مهار کرده و از تخریب بیشتر سلول ها جلوگیری کند.
• سلول ها را با پیپت کردن مکرر از هم جدا کرده و بصورت یک سوسپانسیون سلولی واحد درآورید.
• سلول ها را شمارش کرده و ساب کالچر دهید.

کنترل کیفی

• ظاهر: قرمز، محلول شفاف
• پی اچ: 7.4 – 7.6
• استریلیتی: تایید شده
• طول عمر: 12 ماه

شرایط نگهداری

• به محض دریافت، محصول را در دمای 20- درجه سانتیگراد فریز کنید. بعد از ذوب شدن، محصول برای حدود 2 هفته در دمای 2 تا 8 درجه سانتیگراد پایدار است.
• فریز و ذوب کردن مکرر محصول موجب کاهش فعالیت آنزیمی می شود، بنابراین از این کار اجتناب کنید. بعد از ذوب شدن، محلول را در حجم های کوچکتر تقسیم کرده و برای استفاده های بعدی در فریزر نگهداری نمایید.